研究背景
自噬是細(xì)胞內(nèi)一種通過雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹并降解細(xì)胞質(zhì)成分（如錯(cuò)誤折疊蛋白、損傷細(xì)胞器和入侵微生物）的降解途徑，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞發(fā)育、免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡至關(guān)重要，其失調(diào)與癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。自噬體的形成由ATG蛋白調(diào)控，其中ATG16L1是關(guān)
鍵蛋白，它與ATG12-ATG5結(jié)合形成復(fù)合物，催化LC3脂化，促進(jìn)自噬體形成，并參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌隔離、線粒體自噬及炎癥調(diào)節(jié)。S-棕櫚酰化
是一種可逆的翻譯后修飾，通過在半胱氨酸殘基上添加棕櫚酰基團(tuán)，影響蛋白質(zhì)相互作用和膜結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白功能。
本篇文獻(xiàn)“ZDHHC 7介導(dǎo)的ATG 16 L1的S-棕櫚酰化促進(jìn)LC 3脂化和自噬體形成"，主要為了探索ATG16L1的S-棕櫚酰化位點(diǎn)及其對LC3脂
化和自噬體形成的影響，以期闡明自噬調(diào)控機(jī)制。
研究內(nèi)容
1. ATG16L1發(fā)生S-棕櫚酰化
首先，通過酰基生物素交換（ABE）實(shí)驗(yàn)檢測ATG16L1的S-棕櫚酰化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)HEK293T細(xì)胞中的內(nèi)源性ATG16L1以及MCF7細(xì)胞中過表達(dá)
的ATG16L1均顯示出明顯的生物素信號，表明ATG16L1是一個(gè)S-棕櫚酰化蛋白。此外，使用棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸（2-BP）處理細(xì)胞可
顯著降低ATG16L1的修飾水平，進(jìn)一步證實(shí)了其S-棕櫚酰化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)（EBSS和Torin 1）可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而自噬抑制（VPS34-IN1）則降低其S-棕櫚酰化水平，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化響應(yīng)自噬信號。
2. ATG16L1的S-棕櫚酰化位點(diǎn)
為了確定ATG16L1的S-棕櫚酰化位點(diǎn)，研究者構(gòu)建了多個(gè)截短突變體和位點(diǎn)突變體。通過ABE實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ATG16L1的Cys153是主要的S-棕櫚
酰化位點(diǎn)。突變該位點(diǎn)（C153S）后，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，表明Cys153是關(guān)鍵的修飾位點(diǎn)。
3. ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化的影響
作者利用ATG16L1基因敲除（KO）HeLa細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ATG16L1的缺失導(dǎo)致LC3-II的缺失，而重新表達(dá)野生型ATG16L1可恢復(fù)LC3-II的生成。
然而，表達(dá)S-棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體則無法恢復(fù)LC3-II的生成。在自噬誘導(dǎo)（EBSS或Baf-A1）條件下，野生型ATG16L1可
顯著促進(jìn)LC3-II的生成，而ATG16L1-C153S突變體則無法響應(yīng)自噬誘導(dǎo)，表明ATG16L1的S-棕櫚酰化對LC3脂化過程至關(guān)重要。
4. ATG16L1的S-棕櫚酰化對自噬體形成的影響
通過在ATG16L1-KO HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3，并重新表達(dá)野生型ATG16L1或ATG16L1-C153S突變體，
研究者發(fā)現(xiàn)野生型ATG16L1可顯著增加EGFP-LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（自噬體標(biāo)記）的數(shù)量，而ATG16L1-C153S突變體則無法恢復(fù)自噬體的形成。
進(jìn)一步通過GFP-RFP-LC3雙熒光實(shí)驗(yàn)和透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，野生型ATG16L1可促進(jìn)自噬體和自噬溶酶體的形成，
而ATG16L1-C153S突變體則無法促進(jìn)這些結(jié)構(gòu)的形成。此外，實(shí)驗(yàn)還表明ATG16L1的S-棕櫚酰化缺陷不影響吞噬體的形成，但會抑制自
噬體的成熟。
5. ZDHHC7介導(dǎo)ATG16L1的S-棕櫚酰化
接著，通過共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ZDHHC7與ATG16L1相互作用，并且這種相互作用在自噬誘導(dǎo)條件下增強(qiáng)。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，ZDHHC7過表達(dá)可顯著增加ATG16L1的S-棕櫚酰化水平，而ZDHHC7的催化活性位點(diǎn)突變體（ZDHHC7-C160S）
則無法促進(jìn)ATG16L1的S-棕櫚酰化。在ZDHHC7基因敲除（KO）細(xì)胞中，ATG16L1的S-棕櫚酰化水平顯著降低，而重新表達(dá)
ZDHHC7可恢復(fù)ATG16L1的S-棕櫚酰化，表明ZDHHC7是ATG16L1 S-棕櫚酰化的關(guān)鍵酶。
6. ZDHHC7介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化對自噬的影響
在ZDHHC7-KO細(xì)胞中，LC3-II的生成和自噬體的形成受到抑制，而重新表達(dá)ZDHHC7可恢復(fù)這些過程，而ZDHHC7-C160S突變體則
無法恢復(fù)。此外，ZDHHC7過表達(dá)可促進(jìn)LC3-II的生成和自噬體的形成，而ZDHHC7-KO則抑制這些過程。這些結(jié)果表明ZDHHC7
介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化在LC3脂化和自噬體形成中發(fā)揮重要作用。
7. ATG16L1的S-棕櫚酰化對其相互作用的影響
研究者發(fā)現(xiàn)，ATG16L1的S-棕櫚酰化對其與WIPI2B和RAB33B（WIPI2B通過招募ATG16L1復(fù)合物促進(jìn)LC3脂化，而RAB33B則通過
運(yùn)輸ATG16L1復(fù)合物確保其在吞噬體上的定位）的相互作用具有顯著影響。野生型ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用強(qiáng)于S-
棕櫚酰化缺陷的ATG16L1-C153S突變體。此外，ZDHHC7過表達(dá)可增強(qiáng)ATG16L1與WIPI2B和RAB33B的相互作用，而2-BP處理則
削弱這種相互作用。這些結(jié)果表明，ATG16L1的S-棕櫚酰化通過增強(qiáng)其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進(jìn)ATG16L1復(fù)合物在
吞噬體上的募集，從而促進(jìn)LC3脂化和自噬體的形成。
研究結(jié)論
本研究揭示了ZDHHC7介導(dǎo)的ATG16L1 S-棕櫚酰化通過增強(qiáng)其與WIPI2B和RAB33B的相互作用，促進(jìn)LC3脂化和自噬體的形成，從而為
自噬的調(diào)控提供了新的分子機(jī)制。
參考文獻(xiàn)
Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7
-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):
2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.
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