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【研究背景】
隨著工業化學的迅速發展，新型環境污染物對人類健康和生態系統的影響日益顯著。塑料制品因其輕便、耐用和低成本的特性被廣泛應用于各行各業，但塑料增塑劑的潛在健康危害逐漸受到關注。乙酰三丁基檸檬酸酯（ATBC）作為一種新興的增塑劑，在塑料制造業中占據重要地位，尤其是在獲得歐盟批準用于食品接觸材料后，其使用更加廣泛。然而，越來越多的證據表明ATBC可能通過內分泌干擾和代謝改變等機制對健康造成威脅，且其信號通路與癌癥的發生和發展相關。鑒于此，本研究旨在探討ATBC與口腔鱗狀細胞癌（OSCC）之間的關聯，以期為評估環境健康風險提供科學依據，并為制定相關防護策略奠定基礎。
【研究方法】
研究整合了網絡毒理學、分子對接和分子動力學模擬等多種方法。首先，通過ProTox-3.0、ADMETlab 3.0和ChemBlink數據庫對ATBC進行毒性分析，并從PubChem數據庫獲取ATBC的SMILES序列。隨后，利用Swiss Target Prediction、ChEMBL和TargetNet數據庫以及STITCH數據庫預測ATBC的潛在靶標，并通過UniProt數據庫標準化靶標名稱，構建ATBC的靶標庫。同時，從GeneCards、OMIM和TTD數據庫收集OSCC相關靶標，通過Venn網站確定化合物靶標與疾病靶標的重疊部分，作為ATBC誘導OSCC的潛在靶標。接下來，利用STRING12.0數據庫和Cytoscape3.9.1軟件構建蛋白質相互作用（PPI）網絡，并通過CytoNCA插件篩選核心靶標。使用DAVID數據庫對交集靶標進行GO和KEGG通路富集分析。此外，從NCBI中GEO數據庫獲取GSE74530數據集，識別OSCC組織與正常對照組織之間的差異表達基因（DEGs），并與ATBC相關靶標進行交集分析。最后，利用AutoDock Vina進行分子對接實驗，模擬ATBC與核心靶標的結合模式，并使用Gromacs軟件對蛋白-ATBC復合物進行分子動力學模擬，以評估結合的穩定性和可靠性。
【研究結果】
n 毒理學分析
通過ProTox-3.0、ADMETlab3.0和ChemBlink數據庫對ATBC進行毒理學評估，結果表明ATBC具有致癌性，且對皮膚和眼睛有顯著的刺激潛力，但對內臟器官的毒性不明顯。
n ATBC誘導OSCC的潛在靶標識別
從GeneCards、OMIM和TTD數據庫共收集到2018個潛在的OSCC相關靶標，同時從ChEMBL、TargetNet、Swiss Target Prediction和STITCH數據庫以及相關文獻中確定了445個ATBC相關靶標。通過Venn圖分析，發現107個共同靶基因，這些基因可能在ATBC與OSCC的相互作用中發揮關鍵作用。
n PPI網絡構建與核心靶標篩選
基于STRING數據庫構建的PPI網絡包含106個節點和1483條邊。利用CytoNCA插件進一步分析網絡節點的拓撲特征，篩選出22個核心靶標，包括AKT1、MMP2、BRAF、HSP90AA1、CASP8、SIRT1、MAPK14、GSK3B、AR、CREBBP、MAPK1、ESR1、CASP3、BCL2、PPARG、MMP9、EGFR、ERBB2、MAPK3、PARP1、MDM2和NR3C1，這些蛋白在多種生物過程中發揮著重要作用，可能是ATBC誘導OSCC分子機制的關鍵調控因子。
n GO和KEGG通路富集分析
對107個潛在靶標進行GO富集分析，發現ATBC誘導的OSCC主要涉及蛋白磷酸化、RNA聚合酶II轉錄的正調控、細胞群體增殖的正調控、凋亡過程的負調控、基因表達調控和信號轉導等生物過程，以及細胞質、核質、受體復合體、細胞核、染色質和含蛋白復合體等細胞組分，同時還與核受體活性、蛋白結合、ATP結合和肽酶活性等分子功能密切相關。KEGG通路分析顯示，這些靶標與癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活以及PI3K-Akt信號通路等153條不同通路相關，表明ATBC對細胞信號網絡的廣泛影響。
n OSCC中的DEGs鑒定
對GSE74530數據集分析發現，與健康對照相比，OSCC患者中有1820個上調基因和685個下調基因。通過Venn分析，發現ATBC靶基因與GSE74530數據集中的DEGs之間存在50個重疊基因，其中MMP9、AR、MAPK3、MMP2、PARP1和ERBB2等基因在ATBC誘導的致癌機制中具有關鍵作用。
n 分子對接驗證
對ATBC與基于度中心性排名qian八的核心靶標（AKT1、HSP90AA1、ESR1、CASP3、BCL2、PPARG、MMP9和EGFR）進行分子對接分析，結果顯示這些核心蛋白均與ATBC具有較高的結合親和力，結合能分別為：MMP9（?7.1 kcal/mol）、HSP90AA1（?6.4 kcal/mol）、BCL2（?6.3 kcal/mol）、EGFR（?6.3 kcal/mol）、AKT1（?6.1 kcal/mol）、PPARG（?5.3 kcal/mol）、ESR1（?5.2 kcal/mol）和CASP3（?5.1 kcal/mol）。
n 蛋白-配體復合物的分子動力學模擬
對EGFR-ATBC、HSP90AA1-ATBC和MMP9-ATBC復合物進行分子動力學模擬，結果顯示三個復合物均達到平衡狀態，其中HSP90AA1-ATBC復合物最為穩定。RMSD值顯示蛋白復合物的RMSD一般在0.1-0.3nm之間，配體的RMSD在0.02-0.1nm之間，表明復合物內結合緊密。RMSF分析顯示MMP9-ATBC和HSP90AA1-ATBC復合物整體波動較小，RMSF值保持在1 nm以內，而EGFR-ATBC復合物在大約750、870和1100位殘基處出現明顯峰值，提示這些區域的靈活性增加，可能有助于配體相互作用，促進功能發揮。氫鍵數量變化分析表明，在三次獨立的分子動力學模擬中，配體與三種蛋白之間形成的氫鍵數量在0-2個之間，其中MMP9與ATBC形成氫鍵的頻率高于其他兩種蛋白，暗示MMP9可能與ATBC形成更強或更穩定的相互作用。吉布斯自由能景觀分析進一步揭示了配體-受體相互作用的能量特性和構象變化路徑，低能量的構象狀態主要集中在藍色和綠色區域，代表穩定構象，而紅色區域對應高能量狀態。ATBC與三個蛋白受體結合時，相應的PC1值在0.0-0.3之間，與復合物的RMSD曲線相結合，進一步證實了ATBC-蛋白質受體結合的高穩定性。結合自由能計算結果顯示，ATBC-EGFR復合物的結合自由能zui低（?43.46 kcal/mol），其次是ATBC-HSP90AA1（?38.80 kcal/mol）和ATBC-MMP9（?35.50 kcal/mol），且總結合自由能為負值，表明ATBC與大分子的結合在熱力學上是有利的，疏水效應和靜電相互作用是主要的驅動力。
【研究結論】
本研究通過結合網絡毒理學、分子對接和分子動力學模擬，為理解ATBC可能如何促進OSCC的發展提供了機制上的認識。研究揭示了ATBC的多方面生物相互作用，并確定了可能驅動致癌過程的關鍵分子靶標和通路。這些發現不僅加深了我們對ATBC毒理學特征的理解，還為環境風險評估提供了關鍵證據，特別是在塑料增塑劑的廣泛應用方面。未來的研究應探討塑料增塑劑暴露與其他口腔病理學之間的關聯，如口腔白斑和口腔黏膜下纖維化，以增強對塑料增塑劑相關健康風險的全面評估，并指導政策決策，朝著更安全的環境方向發展。
Guo Y, Liu Y, Chen Y, Du S, Zheng Y, Wang L. The mechanisms of environmental pollutant acetyl tributyl citrate induced oral squamous cell carcinoma using network toxicology, molecular docking and molecular dynamics simulation. Int J Surg. 2025 Jul 24. doi: 10.1097/JS9.0000000000002967. Epub ahead of print. PMID: 40705527.
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